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乳酸(LA)含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法
規(guī)格:100T/48S
提取液:液體50mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體20mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:粉劑×1瓶,-20℃保存。臨用前加入0.6ml試劑一充分溶解??煞盅b后-20℃保存, 避免反復(fù)凍融;
試劑三:粉劑×1瓶,-20℃避光保存。臨用前加入6mL試劑一充分溶解;可分裝后-20℃保存,避免反復(fù)凍融;
試劑四:粉劑×1瓶,-20℃避光保存。 臨用前每瓶加入6mL 試劑一混勻,可分裝后-20℃保存,避免反復(fù)凍融;
試劑五:液體3mL×1瓶,4℃保存。
標(biāo)準(zhǔn)品:粉劑×1支,4℃保存。臨用前加入1.04mL提取液配成100µmol/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液;
顯色液的配制:臨用前根據(jù)用量按照試劑三(V):試劑四(V):試劑五(V)=1:1:0.5的比例充分混勻,現(xiàn)配現(xiàn)用;
乳酸是生物體代謝過(guò)程中重要的中間產(chǎn)物,與糖代謝、脂類(lèi)代謝、蛋白質(zhì)代謝及細(xì)胞內(nèi)能量代謝密切相關(guān),乳酸含量是評(píng)估糖元代謝的和有氧代謝的重要指標(biāo)。乳酸在乳酸脫氫酶的作用下生成丙酮酸,同時(shí)使NAD+還原生成NADH和H+,H+傳遞給PMS生成的PMSH2還原特異性底物, 在450nm處有特征吸收峰。
天平、研缽/勻漿器、離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、乙醇和蒸餾水。
一、樣本處理:
b. 細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量(106個(gè)):提取液一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);于4℃, 12000g離心10min后取上清待測(cè)。
c. 血清(漿):取100µL血清(漿)加入0.9mL提取液,4℃ 12000g離心10min后取上清待測(cè)。
二、測(cè)定操作
1、分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,波長(zhǎng)調(diào)至450nm,分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零。
2、標(biāo)準(zhǔn)液的稀釋:將100µmol/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液用蒸餾水稀釋為10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0µmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液待測(cè)。
3、加樣表:
| 測(cè)定管 | 對(duì)照管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 空白管 |
樣品(µL) | 10 | 10 | - | - |
標(biāo)準(zhǔn)品(µL) | - | - | 10 | - |
蒸餾水(µL) | - | 10 | - | 10 |
試劑一(µL) | 40 | 40 | 40 | 40 |
試劑二(µL) | 10 | - | 10 | 10 |
工作液(µL) | 140 | 140 | 140 | 140 |
于 37℃準(zhǔn)確反應(yīng) 30min。于 450nm 處測(cè)定吸光值,分別記為 A 測(cè)定管,A 對(duì)照管,A 標(biāo)準(zhǔn)管,A 空白管,計(jì)算?A 測(cè)定=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管;?A 標(biāo)準(zhǔn)= A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管。 |
三、乳酸含量的計(jì)算:
1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
以各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為x軸,以其對(duì)應(yīng)的吸光值(?A標(biāo)準(zhǔn))為y軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到標(biāo)準(zhǔn)方程
y=kx+b,將?A測(cè)定帶入公式中得到x(µmol/mL)。2、乳酸含量計(jì)算
(1) 按照蛋白含量計(jì)算
LA含量(µmol/mg prot)=x×V 樣÷V 樣÷Cpr =x÷Cpr
(2) 按照樣本質(zhì)量計(jì)算
LA含量(µmol/g 鮮重)=x×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×W)=x ÷W。
(3) 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
LA含量(µmol/106 cell)=x×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量)=x ÷細(xì)胞數(shù)量
(4) 按照液體體積計(jì)算
LA含量(µmol/mL)= 10×x。
V樣品:加入的樣品體積,0.01mL。:W:樣本質(zhì)量,g/mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL, 蛋白濃度需自行測(cè)定; V提取液:加入的提取液體積,1mL;細(xì)胞數(shù)量,5×106個(gè);V液體:液體樣本體積,0.1mL。
1. 若測(cè)定吸光值?A大于大濃度標(biāo)準(zhǔn)品OD值,請(qǐng)將樣品體積進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯笤龠M(jìn)行測(cè)定,并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
總抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)試劑盒說(shuō)明書(shū)(微量法)