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CCK8檢測(cè)的試驗(yàn)具體內(nèi)容及注意事項(xiàng)
更新時(shí)間:2020-03-24 點(diǎn)擊量:9434
      CCK8檢測(cè)的試劑可用于簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為:該試劑中含有WST-8【化學(xué)名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】。它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓*(1-Methoxy PMS)的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物(Formazan dye)。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。
  一、CCK8檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容:
  取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,每孔按 4×103個(gè)接種至 96 孔板中,每組設(shè)置8個(gè)復(fù)孔,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒后。繼續(xù)培養(yǎng) 48h 后,棄含藥培養(yǎng)基,每孔加入新鮮配制的含 10uL的毒性檢測(cè)液CCK8,置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 4h 后,用酶標(biāo)儀測(cè)波長(zhǎng)為450 nm的OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次, 取實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。按公式計(jì)算生長(zhǎng)抑制率=[(對(duì)照組 OD-實(shí)驗(yàn)組 OD)/對(duì)照組 OD]  ×100%,以分組為橫坐標(biāo),生長(zhǎng)抑制率為縱坐標(biāo),繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率柱狀圖。
  當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí),貼壁細(xì)胞的較小接種量至少為1000 個(gè)/孔(100μl培養(yǎng)基)。檢測(cè)白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對(duì)較低,因此推薦接種量不低于2500 個(gè)/孔(100μl培養(yǎng)基)。酚紅和血清對(duì)CCK8法的檢測(cè)不會(huì)造成干擾,可以通過(guò)扣除空白孔中本底的吸光度而消去。
  二、CCK8檢測(cè)的注意事項(xiàng)
  CCK8可以檢測(cè)大腸桿菌,但不能檢測(cè)酵母細(xì)胞。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每次測(cè)定的過(guò)程中需要避免細(xì)菌污染,以免影響結(jié)果。CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個(gè)月,在-20℃下避光可以保存1年。當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí),培養(yǎng)板較外一圈的孔較容易干燥揮發(fā),由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。一般情況下,較外一圈的孔只加培養(yǎng)基,不作為測(cè)定孔用。在培養(yǎng)基中加入CCK8,培養(yǎng)一定的時(shí)間,測(cè)定450 nm的吸光度即為空白對(duì)照。在做加藥實(shí)驗(yàn)時(shí),還應(yīng)考慮藥物的吸收,可在加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK8,培養(yǎng)一定的時(shí)間,測(cè)定450 nm的吸光度作為空白對(duì)照。金屬對(duì)CCK-8顯色有影響:當(dāng)終濃度為1mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會(huì)抑制5%、15%、90%的顯色反應(yīng),使靈敏度降級(jí)。如果終濃度是10 mM的話,將會(huì)100%抑制。懸浮細(xì)胞由于染色比較困難,一般需要增加細(xì)胞數(shù)量和延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。

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