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α-淀粉酶 ( α-AL) 活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法
注意:正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
規(guī)格:100T/48S
產(chǎn)品內(nèi)容:
試劑一:液體 20mL×1 瓶,室溫保存。若有黃色晶體析出,可適當(dāng)加熱溶解后再用。
試劑二:粉劑×1 瓶,4℃保存。臨用前加入 10mL 蒸餾水,置于常溫水中并加熱至煮沸,期間 不斷攪拌粉劑至溶解。
標(biāo)準(zhǔn)品:粉劑×1 支,10mg 無(wú)水葡萄糖,臨用前加 1mL 蒸餾水,配成 10mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。
產(chǎn)品說(shuō)明:
淀粉水解酶,包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-AL (EC 3.2. 1. 1)隨機(jī)催化淀粉中α- 1,4-糖苷鍵水解,生 成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖,同時(shí)使淀粉的粘度降低,因此又稱為液化酶。
淀粉水解酶催化淀粉水解生成還原糖,還原糖還原 3,5-二硝基水楊酸生成棕紅色物質(zhì),在 540 nm 有吸收峰;通過(guò)測(cè)定 540 nm 吸光度增加速率,計(jì)算淀粉酶活性。α-AL 耐熱,但是β-淀粉酶可在 70℃ 鈍化 15min 。因此粗酶液經(jīng)過(guò) 70℃鈍化 15min ,就只有α-AL 能夠催化淀粉水解。
需自備的儀器和用品:
酶標(biāo)儀或可見(jiàn)分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96 孔板/微量比色皿、 研缽和蒸餾水。
操作步驟:
一、粗酶液提取:
稱取約 0. 1g 樣本,加 0.8 mL 蒸餾水勻漿;勻漿后在室溫下放置提取 15min ,每隔 5min 振蕩 1
次,使其充分提?。?000g ,室溫離心 10min ,吸取上清液并且加蒸餾水定容至 10 mL ,搖勻,即為 淀粉酶原液。
二、測(cè)定步驟和加樣表 (在 EP 管中依次加入下列試劑):
1 、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 540 nm ,蒸餾水調(diào)零。
2 、將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋為 1 、0.5 、0.25 、0. 125 、0.0625 、0.03125 、0.015625 、0.0078 和 0.0039mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。
3 、按操作表依次加入各試劑:
試劑 (μL)對(duì)照管測(cè)定管標(biāo)準(zhǔn)管空白管
α- 淀粉酶原液7575--
蒸餾水---75
標(biāo)準(zhǔn)溶液 (mg/mL)--75-
70℃水浴 15min 左右,冷卻
試劑一150---
將以上對(duì)照管、測(cè)定管和試劑二置于 40℃恒溫水浴中保溫 10min 左右
試劑二75757575
在 40℃恒溫水浴中準(zhǔn)確保溫 5min
試劑一-150150150
混勻,90℃ 水浴 10min ,取 200μL 至 96 孔板或微量比色皿中,540nm 處讀取對(duì)照管、測(cè)定管、 標(biāo)準(zhǔn)管、空白管的吸光度,分別記為 A 對(duì)照、A 測(cè)定、A 標(biāo)準(zhǔn)和 A 空白,計(jì)算ΔA 測(cè)定=A 測(cè)定-A 對(duì)照,ΔA 標(biāo)準(zhǔn)=A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白。
三、α-淀粉酶活性計(jì)算:
1 、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
以ΔA 標(biāo)準(zhǔn)為 y 軸,以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為 x 軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到方程 y=kx+b 。將ΔA 測(cè)定帶 入方程得到 x (mg/mL)。
2 、α- 淀粉酶活性的計(jì)算
a. 按照樣本鮮重計(jì)算
單位定義:每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生1mg 還原糖定義為1個(gè)酶活力單位。
α- 淀粉酶活性(mg/min/g 鮮重)=x×V 樣÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T=2×x÷W
b. 按照蛋白質(zhì)濃度計(jì)算
單位定義:每mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1mg 還原糖定義為1個(gè)酶活性單位。 α-淀粉酶活性(mg/min/mg prot)= x×V 樣÷ (V 樣×Cpr) ÷T=0.2×x÷Cpr
V 樣:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.075 mL;V 樣總:提取液總體積,10 mL; Cpr:樣本蛋
白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g;T :反應(yīng)時(shí)間,5min。
注意事項(xiàng):
當(dāng)測(cè)定的吸光值大于 1.5 時(shí),可以對(duì)樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋后測(cè)定。
本產(chǎn)品僅供科學(xué)研究使用!請(qǐng)勿用于臨床、診斷、食品、化妝品檢測(cè)等用途!
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