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禽流感病毒H5/H7/H9型（H5/H7/H9）三重核酸檢測試劑盒

(熒光RT-PCR法)

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：禽流感病毒H5/H7/H9型（H5/H7/H9）三重核酸檢測試劑盒(熒光RT-PCR法)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預(yù)期用途】

禽流感病毒(AIV)屬甲型流感病毒。流感病毒屬于RNA病毒的正黏病毒科，分甲、乙、丙3個型。其中甲型流感病毒多發(fā)于禽類，一些甲型也可感染豬、馬、海豹和鯨等各種哺乳動物及人類；乙型和丙型流感病毒則分別見于海豹和豬的感染。甲型流感病毒是依據(jù)病毒表面的血細(xì)胞凝集素（H）和神經(jīng)氨酸酶（N）來命名，其中H有16個亞型，N有9個亞型。本試劑盒適用于檢測標(biāo)本中的流感病毒H5、H7和H9亞型病毒RNA，適用于流感病毒H5、H7和H9亞型感染的輔助診斷及流行病學(xué)調(diào)查。

【檢驗原理】

本試劑盒用流感病毒H5、H7和H9亞型的特異性基因，分別設(shè)計2條特異性引物，分別結(jié)合1條特異性熒光探針，用一步法熒光RT-PCR技術(shù)對流感病毒H5、H7和H9亞型的RNA進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復(fù)凍融不超過5次，有效期12個月。

【適用儀器】

ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus、安捷倫MX3000P/3005P、MJ Opticon2、Eppendorf 2/4 Color Systems、Bio-RadCFX96 等熒光定量PCR檢測儀。

【標(biāo)本采集】

病死或撲殺禽，取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織；待檢活禽，采集1ml血液樣本置于1.5ml滅菌離心管中，或用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物，置于1mL 50%甘油生理鹽水中。

【保存和運輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過6個月，標(biāo)本運送應(yīng)采用2~8℃冰袋運輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1 樣本前處理

每份組織分別從3個不同的位置稱取樣品約1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中；棉拭子直接取100μL于1.5mL滅菌離心管中；血液樣本待血凝后取血清100μL于1.5mL滅菌離心管中。

1.2 RNA提取

為了使實驗結(jié)果穩(wěn)定、有效、可靠，建議使用商品化的RNA 提取試劑盒進(jìn)行提取，嚴(yán)格按照對應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照；樣品每滿7份，多配制1份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟1提取的RNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取5μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4. PCR擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2 設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為25μL；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM檢測禽流感病毒H5亞型、HEX/VIC檢測禽流感病毒H7亞型，CY5通道檢測禽流感病毒H9亞型，淬滅通道（Quencher Dye）選擇NONE，請勿選擇ROX參比熒光。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

5. 結(jié)果分析判定

5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置Baseline和Threshold：一般直接按機(jī)器自動分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值(一般可在3~15范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop值(一般可在5~20范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

5.2 結(jié)果判斷

陽性：檢測通道Ct值≤38.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。

可疑：檢測通道38.0<Ct值<40.0，且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線的樣本建議重復(fù)試驗，重復(fù)試驗結(jié)果出現(xiàn)Ct值<40.0且有典型擴(kuò)增曲線者為陽性，否則為陰性。

陰性：樣本檢測結(jié)果無Ct值且無明顯的擴(kuò)增曲線。

6. 檢測方法的局限性

? 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

? 陽性對照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

? 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

? 不同的提取方法存在提取效率差異，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

? 試劑運輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果；

? 本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

7. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：無明顯擴(kuò)增曲線且無Ct值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長期，且Ct值≤30；

以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。

8. 性能指標(biāo)

（1）敏感性：內(nèi)控樣本敏感性為100%，綜合評價敏感性98%以上。最低檢測限不低于1000copies/ml。

（2）特異性：100%。

（3）穩(wěn)定性：批內(nèi)及批間差異≤3%。

【注意事項】

? 所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；

? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完全混勻并短暫離心；

? 反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

? 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

? 實驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

? 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進(jìn)行處理。

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